A DNS izolálása a vérből,

előző ◈ a következő
  1. kapjon vért önkéntes vénájából;
  2. hozzáadunk 0,5 M EDTA-t 50 mM-ig => 1 / 10V;
  3. mix:

egy vérkészítmény EDTA => 1V,
puffer 1 => 6V;

  • 0 ° C, 1-4 óra;
  • DF 1,5 rpm, 4 ° C, 15 ';
  • távolítsa el a felülúszót;
  • a magok pelletét "pufferben" 2 térfogatban szuszpendáljuk, a térfogat 0,8 V-nak felel meg;
  • hozzáad

    proteináz K legfeljebb 50 ng / ml,
    SDS 10% - 1%, => 1 / 10V;

  • 37 o C, ON;
  • adjunk hozzá 3.0M AcONa pH 7,5-t 0,3M-ig => 1 / 10V;
  • finoman extraháljuk semleges F, Ф: Х, Х (ЦФ 5 krpm, NT, 10 ');
  • csapadék válik ki NaCl / EtOH-val;
  • öblítjük 70% -os EtOH-dal;
  • a csapadékot feloldjuk vízben.
  • Az EDTA megakadályozza a véralvadást. Bizonyos módszereknél heparint használnak erre, de ez a PCR hatékony inhibitora, és biztonságosan áthalad a teljes tisztítási eljáráson.
  • A Triton X-100 lágyítja a sejtmembránt, de nem pusztítja el a sejtmagot. Ebben a szakaszban a vérsejtek kinyílnak, csak a magok a leukocitákból maradnak.
  • Leukocyta magok lebontása.
  • A magok szuszpenziójának előállítása.
  • Protein Cleavage Prot.K.
  • Valószínűleg egy előítélet, én általában elhagyom az éjszakát 37 o C-on, és néhány órát 50 o C-on.
  • 37 ° C-on végzett inkubálás után 1-2 napig megszakadhat (tárolás +4 o C-on).
  • A só jobb hozzáadni a fenol extrakcióhoz, mert Az alacsony sótartalmú pufferben lévő fenollal végzett extrakció jelentős DNS veszteséggel járhat.
    • Lásd még:
    / linkek a hálózati erőforrásokhoz /
    • A PCR-ből származó DNS-izolálás módszerét a száraz vér foltokról a fórumon tárgyaltuk. Gyorsan működik, elég a Chelex-100 gyantával vízben forrni a mintát és a felülúszót felvenni. Forenzikában használják.

    Ma a fő feladat - az elosztása a teljes DNS egér szervek (lép, csontvelő cél, a vér, a bőr, hólyag) kimutatására a DNS a kórokozó a PCR. kórokozó - a baktérium (amelynek nincs sejtfala) intra- és extracelluláris lokalizációja.

    kérdés:
    1. érdemes-e GITC-t használni, vagy elegendő proteináz (mielőtt csak proteinázzal dolgoztak)?
    2. A szerv átvétele pillanatától kezdve a mélyfagyásig (-70) 5 óráig tart. van-e értelme fixáló vagy lízis megoldások alkalmazásában? alkohol, aceton, ugyanaz a GITC?
    3. A vér minden világos számomra, de szervek, különösen a meglehetősen kemény kötőszövet keret (hólyag) is elegendő, ha a szokásos koncentrációban proteináz, vagy meg kell próbálnia, hogy növelje meg?
    4. a protokollokban a fenol-kloroform extrakciós lépés (1: 1) jelenléte és hiánya hiányzik. és így tovább. HZ még csak nem is tudta, vajon szükség van-e rá. mi az elméleti előfeltétele ennek a szakasznak?
    5. Egyes protokollokban kloroformot használnak, más esetekben a kloroform izoamil-alkohol (24: 1). van ebben a keverékben különleges jelentőség?
    6. Frissen vásárolt kloroform képesítés hch pergon nem szükséges, azt hiszem?
    7. Itt még sokáig megkérdőjelezték a kérdést - a lizáló oldatokban guanidin izotiocianátot használnak, és miért nem lehetséges a klorid? Nagy mennyiségű guanidin-klorid van. nem éri meg a pénzt költeni?

    1. Felvetem a kérdést. A guanidinnel gyorsabb
    2. GITC, és ha ez csak a kórokozó kimutatása, akkor dobja el a szervet a hűtőbe
    3. Hagyományos koncentráció elegendő, növelheti az időt
    4. Ha proteinázot használunk, fenol-kloroformmal történő mosás kötelező, és minden esetben kívánatos
    5. Nem láttam a különbséget
    6. jobb használni a "molekuláris biológia"
    7. izotiocianátos lyserek jobb, és a többi - nem érdekel

    Az izoamil-alkoholt a kloroformhoz adagoljuk, így a keverék nem habosít - ez minden.

    Kapcsolódó cikkek

    előző ◈ a következő