A történelem a fejlődés PCR
Polimeráz láncreakció
Polimeráz láncreakció (PCR) - kísérleti biokémia módszer megvalósítása jelentős növekedéséhez kis koncentrációban egyes fragmentovDNKv biológiai anyag.
Amellett, hogy az amplifikációs (a kópiaszám növekedéséhez) DNS, PCR lehetővé teszi sok más nukleinsavak manipulálása (mutáció bevezetésére, splice DNS fragmentumok), és széles körben használják a biológiai és orvosi gyakorlatban, például, a diagnózis (genetikai, fertőző), apasági, dlyaklonirovaniyagenov, elosztása novyhgenov.
A korai 1970-es évek godovnorvezhskomu uchenomuHellyu Kleppeiz laboratóriumi Nobel laureataHara Gobind Horanyprishla az elképzelést, hogy lehetséges, hogy amplifikáljuk a DNS-t egy-egy pár rövid, egyszálú DNS-molekulák - sinteticheskihpraymerov.
Bár ez a gondolat maradt gazdátlan. De 1983-ban már sikeresen megvalósított Cary Mullis.
A célja az volt, hogy egy olyan eljárás, amely lehetővé tenné amplifitsirovatDNK során posledovatelnyhudvoeniyiskhodnoy több DNS molekulával keresztül fermentaDNK polimeráz.
A PCR-módszer alapja a természetes folyamatot - kiterjesztést a komplementer DNS-templáthoz, által végzett DNS-polimeráz enzim. Ezt a reakciót nevezzük a DNS replikáció.
A természetes DNS-replikáció során több szakaszban:
1) DNS denaturálása (kisimulás kettős hélix DNS-szál divergencia);
2) képződése rövid kettős szálú DNS-szegmensek (primerek megindításához szükséges, a DNS-szintézis);
3) szintézise egy új DNS-szál (komplementer kiterjedés mindkét szál)
Carey Mullis azt mutatja, hogy ezt a folyamatot fel lehet használni másolatának megszerzése rövid szakaszok DNS, amely kifejezetten egy bizonyos organizmusok, azaz elvégzésére célzott keresést ezeken a speciális területeken.
Előállításához denaturálása a DNS-t, azt melegítjük.
Elején a módszer, minden egyes ciklus után a fűtési - hűtés szükséges volt, hogy egy új részét a reakcióelegy egy DNS-polimeráz, mert gyorsan inaktiválódnak magas hőmérsékleten szükséges szálszétválasztást a DNS hélix. Az eljárás nagyon hatékony, igényel sok időt és enzimet tartalmaz.
1986-ban godumetod polimeráz láncreakció jelentősen javult. Javasolták már, hogy használni DNS polimerázok termofil baktériumból származó. Ezek az enzimek voltak termikusan stabil, és kibírják a különböző reakció ciklusok.
Használatuk lehetséges egyszerűsítése és automatizálása a PCR-t. Az egyik első termostabil DNS polimeráz-t izoláltunk a Thermus aquaticus baktériumok és elemzi Taq-polimeráz. A hátránya ennek a polimeráz az, hogy a valószínűsége, hogy egy helytelen nukleotidot elég magas a szintje, mivel ez az enzim nincs hiba korrekciós mechanizmusok (3 „→ 5” ekzonukleaznayaaktivnost).
Pfu-polimerázzal és a Pwo. származó Archaea van ilyen mechanizmus, használatuk jelentősen csökkenti a mutációk számát, a DNS-t, de a működési ütemének (processzivitással) alacsonyabb, mint uTaq. Most alkalmazni keveréke Taq és Pfu. egyidejűleg elérni magas polimerizációs sebesség és a nagy pontosságú másolás.